多色熔解曲线分析技术在多色荧光的基础上结合了熔解曲线分析，增加了单一荧光通道可检测靶标数量，保留荧光PCR优点的同时使可检测靶标数大大增加，在分子诊断技术领域具有广阔前景。
百力格结合底层技术方法创新，开发专能优品，形成核酸原料、酶、荧光标签三套熔解曲线解决方案。
技术介绍
熔解曲线法基于不同DNA双螺旋结构变性一半的温度（熔解温度Tm）不同，在PCR反应结束后，通过逐渐升高温度的方式，监测荧光信号变化与温度的关系曲线（熔解曲线），通过分析每个靶标对应的熔解曲线，实现各个靶标的检测。
非对称熔解曲线：
采用不对称扩增，使用不同浓度或Tm值差异较大的上游引物和下游引物，PCR扩增后将产生一定比例的单链产物。该方法由于是线性扩增，扩增产量低，灵敏度低，同时，上下游引物比例难于优化，设计难度较大，容易出现基线平、“鼓包”等问题。
对称熔解曲线：
采用对称扩增，上游引物和下游引物的浓度相同， PCR扩增产物为双链DNA。该方法是指数扩增，灵敏度高，但对称扩增没有单链产物，在建立荧光强度和Tm值之间的关系时存在技术壁垒。
熔解曲线专用酶解决方案
BioZues® Mc HS Taq DNA Polymerase
为了解决非对称熔解曲线技术难题，百力格全新推出抗体封闭的BioZues® Mc HS Taq DNA Polymerase，具有极低5’-3’外切核酸酶活性，适用于熔曲qPCR各种场景包括SNP分型，超多重检测等，不适用于探针法qPCR。可应用于胚系突变的SNP检测，检测核酸为基因组DNA，例如药物基因组学、化疗用药检测、精神病用药检测等。
产品信息
货号 | 产品 | 浓度 | 规格 |
SE0431-005 | BioZues® Mc HS Taq DNA Polymerase | 5 U/μl | 500 U |
SE0431-025 | 2500 U | ||
SE0431-500 | 4 x 2500 U |
产品特点
1. 多重扩增效果好，单管检测可达16个靶标
2. 灵敏度高，每个靶标检测低至0.1ng/反应
3. 不对称扩增单链产量高
4. 抗抑性好，兼容不同样本类型，可用于血液直扩
5. 分型效果好，可解决不对称扩增中，上下游引物比例难于优化，设计难度大的问题
实际样本测试数据
多重扩增测试
使用SE0431在非对称PCR体系中进行单孔8个靶标检测，结果显示：SE0431能明显区分杂合型、野生型和突变型，并且熔曲峰值高，峰形清晰，基线稳定。
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| 杂合型(HET) | 野生型(WT) | 突变型(MT) |
抗抑性测试
使用SE0431，分别以野生型质粒、人细胞gDNA、人全血gDNA、人血斑卡gDNA为模板，1ng/ul的gDNA进行单孔4个靶标检测，结果显示：在多种形式的样品中均能进行有效SNP分型，具有较好兼容性，可用于血筛、血液直扩等。
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| 质粒 | 基因组DNA |
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| 全血 | 血斑卡 |
荧光标签解决方案
BioZues® Multiplex qPCR Mc Probe Kit
熔解曲线法通常对靶标碱基的依赖性较高，碱基突变会引起熔曲峰（Tm值）偏移，可能产生漏检或误判。RNA靶标稳定性较低，容易产生突变，因此多数熔曲方法不兼容RNA靶标。百力格荧光标签解决方案采用非靶标依赖的熔曲方法，用高分子聚合物荧光标签取代一般荧光基团，由相应的荧光标签产生不同Tm值的熔解曲线。适用于一管式多靶点检测，包括病原体的DNA、RNA检测等。
产品特点
1. 多重扩增效果好，单管检测最多可达16个靶标
2. 适用于对称溶、熔解曲线法，灵敏度更高，每个靶标检测可达 20copies/反应
实际样本测试数据
多重扩增测试
使用CM0101，以HPV典型突变位点为靶标，进行单孔7个靶标测试，结果显示：单孔中不同靶标均能有效检出，每个靶标检出限均可达20copies/反应，四通道并孔也能进行7个靶标明确区分。
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| FAM 通道：HPV 51 16 | VIC 通道：HPV 45 26 |
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| ROX 通道：HPV 82 18 | CY5 通道：HPV 31 |
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| 4通道 并孔 |
熔曲解决方案选择指南
方案编号 | 解决方案 | 产品编号 | 应用场景 | 适用方法 |
方案一 | 熔解曲线荧光探针（RQp系列） | / | 一管式多靶点检测，包括病原DNA多重，多联检等 | 非对称熔解曲线法 |
方案二 | 熔解曲线荧光探针（RQ系列） | / | 对称熔解曲线法 | |
方案三 | 不对称熔曲专用酶 | SE0431 | SNP分型检测，例如胚系突变的SNP检测，药物基因组学、化疗用药检测、精神病用药检测 | 非对称熔解曲线法 |
方案四 | 熔曲荧光标签法 | CM0101 | 病原体的DNA、病原体的DNA、RNA检测 | 对称熔解曲线法 |
