常见问题

• 1.核酸换算

  更新时间：2023-03-01

  1. 摩尔数与质量 

  1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol     

  1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol     

  1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol     

  1 μg lambda phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol     

  1 μg M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.21 pmol     

  1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol     

  1 μg pUC18/19 DNA (2,686bp) = 0.57 pmol    

  1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 μg

  1 pmol M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 4.78 μg

  1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 μg

  1 pmol pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.77 μg

  1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg

  1 pmol lambda phage DNA (48,502bp) = 32.01 μg

  1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 μg

  
  

  2.光吸收值与浓度

  1 OD260 dsDNA = 50  μg/ml

  1 OD260 ssDNA = 33  μg/ml

  1 OD260 ssRNA = 40  μg/ml

  
  

  3.分子量

  1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons

  1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons

  
  

  4.核酸末端浓度

  线性DNA：pmol ends = pmol DNA ′ (number of cuts ′ 2 + 2)

  环状DNA：pmol ends = pmol DNA ′ number of cuts ′ 2

  1 μg 线性1,000bp DNA = 3.04 pmol ends     

  1 μg 线性 FX174 DNA (5,386bp) = 0.56 pmol ends

  1 μg 线性 pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.14 pmol ends     

  1 μg 线性 SV40 DNA (5,243bp) = 0.58 pmol ends

  1 μg 线性 pBR322 DNA (4,361bp) = 0.7 pmol ends     

  1 μg 线性 lambda phage DNA (48,502bp) = 0.06 pmol ends

  1 μg 线性 M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.42 pmol ends

  
  

  
  

• 2.DNA测序的原理是什么？步骤如何？ABI 3730XL测序的准确程度如何？

  更新时间：2023-03-01

  DNA测序的原理是末端终止法。具体步骤如下：

  1.定量：对样品及引物进行定量。

  2.测序反应：在反应体系中加入已定量的模板和引物，BigDye等试剂，PCR仪上完成测序反应。

  3.读取数据：根据荧光的不同，读取被测样品的碱基序列。ABI公司目前承诺测序结果在800bp以内准确率为98.5%。

• 3.纯化方式及其详细说明

  更新时间：2023-02-28

  脱盐(DSL) 合成完成的寡核苷酸通过高纯氨气混合水蒸汽,在高温高压下将连接在CPG上的引物切下来后通过普通相层析柱进行层析除盐。Cartrige纯化 Cartrige纯化是通过反相净化介质 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，Cartrige是一种有效并且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。

  
  

  PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对引物DNA进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于90%，对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效。

  
  

  HPLC纯化 HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中，常用的是反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：纯度大于90%； HPLC纯化主要用于修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高，批量生产效率不高。

• 4.如何测定引物的OD值？

  更新时间：2023-02-28

  用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

• 5.核苷酸的换算

  更新时间：2023-03-01

  1.分子量

  MW (Da) = 333 ′ N (number of bases)

  
  

  2.浓度

  C (mmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 ′ N) C (ng/ml) = OD260 ′ MW / (0.01 ′ N)

  注：MW —— molecular weight；N —— number of bases；OD260 —— absorbance at 260 nm

  
  

  3.双链DNA与寡核苷酸的熔点：

  短于20bp的双链寡核苷酸：Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

  长于20bp的双链寡核苷酸： Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) –(600/N) 

  注： N —— 引物的长度(以碱基数计算)；J+ —— 单价阳离子浓度

  
  

  4.DNA与表达蛋白之间分子量换算

  1 kb DNA = 333 amino acid ≈ 3.7 ′ 104 Da

  10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA     30,000 Da Protein ≈ 810 bp DNA

  50,000 Da Protein ≈ 1350 bp DNA     100,000 Da Protein ≈ 2700 bp DNA

• 6.为什么在测序报告上找不到我的引物序列？

  更新时间：2023-03-01

  1. 如果您提供的样品是PCR产物，在测序报告上找不到您的引物是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，而测序引物由于没有荧光标记，因此自然在测序结果中就不会被识别。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物（<800bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。

  2. 如果您提供的样品是质粒或菌液，PCR产物用载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条链上找不到您的引物序列时,请尝试在互补链上寻找您的引物序列。

  3. 当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。

   4. 有时，质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。

• 7.怎样溶解引物？

  更新时间：2023-02-28

  我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。

• 8.我的引物做PCR效果很好，为什么用于测序总得不到好的结果？

  更新时间：2023-03-01

  用于测序的引物比用作PCR反应的引物要求高，以下是不适合用于测序反应的引物类型：

  
  

  1.不纯的引物：用于测序的引物纯度要求很高，合成中的小片段会直接造成严重的背景峰，因此用于测序的引物序列长度一般在24个碱基之内，因为过长的引物纯度不易保证。

  2.简并引物，随机引物和有特殊标记的引物。

• 9.合成的引物应如何保存?

  更新时间：2023-02-28

  没有溶解的引物/探针可以在-20℃下保存至少24个月，溶解好的引物/探针可以事先稀释为 100uM 的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少18个月以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前，将浓溶液稀释成工作液(10pmol/ul或20pmol/ul)后进行实验。

  
  

• 10.如何检测引物的纯度？

  更新时间：2023-02-28

  实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带)。

• 11.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?

  更新时间：2023-02-28

  没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。

• 12.合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?

  更新时间：2023-02-28

  PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。

  1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?

  2) 引物本身是否有立体结构.

  3) PCR反应用试剂是否能正常工作?

  4) PCR仪是否工作正常?5) PCR反应条件是否合适?如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。

• 13.密码子优化有必要吗？

  更新时间：2023-03-01

  有必要。不同来源的种属密码子的偏好性不同。比如，在人体内受偏爱的密码子对于E. coli来说可能是稀有的。百力格公司已经为国内外客户优化了大量的基因，有自主研发的专业软件。可免费为客户提供密码子优化服务。

• 14.定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8，引物的纯度合格吗?

  更新时间：2023-02-28

  由于核酸在260nm附近有强吸收，而蛋白质在280nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同， 例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.

• 15.百力格公司的标准免费克隆载体是什么？

  更新时间：2023-03-01

  (1) pUC系列（pUC18/pUC19/pUC57），pBuescript II SK(+l)，PCR2.1等载体：含有若干常用限制性内切酶识别序列；

  (2) pTG19-T 载体：适用于T/A克隆；另外，本公司还有近300种商业表达载体（如pET系列，pPIC系列）可供基因合成后克隆选择；

  若有特殊要求，需换到一些特殊载体或改造过的载体，为方便后续实验的及时进行，请提供载体及相关的载体信息。

• 16.用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反应？

  更新时间：2023-02-28

  一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。 EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95℃ 2mins，然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。

• 17.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的引物，发现有很多条泳带，为什么?

  更新时间：2023-02-28

  对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。

• 18.能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?

  更新时间：2023-02-28

  不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

• 19.必须要签定合同与交纳50%预付款吗?

  更新时间：2023-03-01

  是的，为保障双方权利与信誉，应该这么做。

• 20.2OD的引物可以多少做次PCR反应？

  更新时间：2023-03-01

  一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。

• 21.引物在常温下运输，会降解吗？

  更新时间：2023-03-01

  不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

• 22.合成的荧光标记探针应如何保存?

  更新时间：2023-03-01

  1) 荧光探针必须避光保存。

  2)干品请于-20℃保存。

  3) 强烈建议用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。通常，将探针配制成100 pmol/ul的储备液，分装成几份 (避免反复冻融)，于-20℃保存。使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩余部分于-20℃保存。

• 23.电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

  更新时间：2023-03-01

  1) A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同；

  2) DNA的立体结构不同，电泳速度不同。 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。

• 24.PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办?

  更新时间：2023-03-01

  1) 因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时，请重新挑选一个克隆测序，会得到正确的结果。

  2) 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。

• 25.客户收到的基因为什么质粒切不动，或切不全?

  更新时间：2023-03-01

  可能原因如下：

  (1)质粒上酶识别序列不正确或者没有；

  (2)酶切反应条件不合适

  (3)限制性内切酶对DNA甲基化敏感；

  (4)内切酶稀释不正确或加入方法不正确；

  (5)甘油浓度过高；

  (6) 限制性内切酶已部分或全部失活；

  (7)保护碱基引入导致侧翼链锁死酶切位点。

  
  

  对策：

  (1)检查质粒DNA中是否存在可被限制酶识别的DNA序列。

  (2)优化酶反应体系，使用随酶提供的反应缓冲液；增大酶量或更换新酶。

  (3)检查DNA是否已被甲基化，所用的酶是否对甲基化敏感。

  (4) 更换保护碱基，或PCR扩增目的片段，酶切PCR产物。

• 26.进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办?

  更新时间：2023-03-01

  1) 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证。

  2) 我们可以免费重新合成引物。

  3) 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。

• 27.如何运输以及保存质粒及其菌株？

  更新时间：2023-03-01

  我们为您提供含有完全正确的基因序列的质粒（不少于5ug）两管。质粒可常温运输，溶解后需－20℃保存，并尽量避免反复冻融。

• 28.客户提供样品做相关服务时，送样要求有哪些？

  更新时间：2023-03-01

  质粒样品，可以是穿刺菌、甘油菌、冻干质粒或质粒溶液等形式。

  
  

  1)穿刺菌：请提供穿刺培养的单克隆菌落。穿刺培养的菌可以长时间保存而不会导致质粒的拷贝数明显下降。样品请在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相应抗生素的固体LB培养基，然后将单菌落用牙签穿刺于LB固体培养基中。

  2)菌液：请将过夜培养的菌液加灭菌甘油至终浓度20%保存于1.5ml或2ml的Eppendorf管中，注意封口，以免污染。

  3)质粒：请提供3-5ug溶于无菌去离子水的质粒溶液或者抽干质粒。

  4)注意：

   a. 请将装有样品的Eppendorf 管口用封口膜封紧，防止运输途中开盖导致样品污染或者丢失。

   b. 请在管壁上注明质粒名称及抗性。

   c. 载体其他信息请以邮件或便签等形式告知。

• 29.平端的PCR产物难以克隆，为什么?

  更新时间：2023-03-01

  由于一般的PCR用引物的5′末端都没有磷酸基团，因此，扩增后的PCR产物的5′末端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对PCR产物的5′端进行磷酸 (PO4修饰) 化处理。

• 30.进行反义核酸实验时，是否要对DNA链全部进行S代修饰，除了S代外，还有什么办法可增加核酸在生物体内的稳定性?

  更新时间：2023-03-01

  DNA经S代修饰后比较稳定，在细胞中不会被核酸酶降解。如果整条链全部S代，的确能增加DNA的稳定性，但会降低其Tm值，也即降低该反义DNA与靶序列的结合效率。因此，科研人员一般采用将DNA片段两端插入数个(通常3个)S代磷酯键Phosphorothioated Bonds)，这样既能增加DNA的稳定性，又能增加反义DNA与靶序列的结合能力。不过如果要将反义DNA注入到活的动物体内，为增强稳定性，还是将整条链S代效果更好。

• 31.FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别?

  更新时间：2023-03-01

  它们皆是荧光素标记 (Fluorescein)，5-FAM与6-FAM互为异构体；而FITC则在与Oligo的连接方式上(硫脲键) 有别于前者(酰胺键)，但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。

• 32.淬灭基团为TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同?

  更新时间：2023-03-01

  由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes)，或称"TaqMan"探针，用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图)，作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下：

  1) TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发射荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底 (Background)相对较高。而Eclipse及BHQ系列为非荧光染料，淬灭报告基团，但自身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高。

  2) 淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱迭盖(Overlapping),也即报告基团的荧光光谱应与淬灭基团的吸收光谱相交搭。对比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光谱，可见TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄，可与之匹配的报告基团种类比较少；而Eclipse则具有更宽的吸收范围(390 nm-625 nm)，可淬灭的报告基团种类很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，从430 nm一直到近红外，可淬灭的报告基团种类更多 (象Cy3、Cy5等的淬灭效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

• 33.TaqMan 探针设计时应遵循哪些原则?

  更新时间：2023-03-01

  1) 探针应位于两引物之间；

  2) 探针中碱基G、C的含量应在20%～80%之间；

  3) 避免同种碱基成串出现，特别是碱基“G”；

  4) 碱基G不要出现在5’末端；

  5) 探针的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，应在68～70℃之间；

  6) 探针长度超过30个碱基时，最好把淬灭基团放在中间，以防止荧光本底过高，这时探针的3’末端应加磷酸基封阻，以防探针在PCR反应过程中延伸。

• 34.何谓分子信标 (Molecular Probes)？与普通的双标记探针 (如TaqMan探针)相比，在使用上有什么特殊性？

  更新时间：2023-03-01

  Molecular Probes是一类特殊的双标记探针，通常状态下，其两末端互补配对，形成茎-环结构 (发卡环结构)，发卡环结构迫使分别连在两末端的报告基团与淬灭基团紧密邻近 (此时检测不到荧光)，而一旦杂交到靶序列上，则报告基团与淬灭基团分开，Molecular Probes变得明亮起来，可检测到荧光。由于发卡环结构的存在，探针对靶序列检测的特异性增强，相对于普通的双标记探针 (如TaqMan探针)，Molecular Probes对SNP有更强的识别能力，能区分序列上仅相差一个碱基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP检测。此外，Molecular Probes也应用于活体细胞内的mRNA杂交、RNA加工、及转录过程的时时监测研究等。